Isolation of rennin gene from Rhizomucor miehei

Rashedi, Parvaneh and Zare, Naser and Fathi, Bahram and Asghari Zakaria, Rasool (2016) Isolation of rennin gene from Rhizomucor miehei. Masters thesis, University of Mohaghegh Ardabili.

[img] Text (جداسازی ژن رنین ازقارچ رایزوموکور میهی (Rhizomucor miehei))
Parvaneh rashedi.pdf

Download (1MB)
Official URL: http://www.uma.ac.ir

Abstract

In this study, the coding sequence (CDS) of renin gene in the Rhizomucor miehei was obtained from the NCBI database, and specific primers were designed to amplify the renin gene. To facilitate gene cloning in the pET-28a expresion vector, restriction site of BamHI and EcorI enzymes were added to the 5’ ends of primers. In the next step, total RNA was extracted from Rhizomucor miehei and then cDNA synthesised using oligo dT primers and cDNA synthesis kit (SinaClon). finally, renin cDNA prolifererated by PCR usin renin specific primers containing BamHI and EcoRI restriction sites and MaxTag DNA polymerase. Ampilfied cDNA were cloned in the pET-28a vector under the control of T7 promoter and terminator, and transform in to into DH5α strains of E. coli. Transformed colonies were selected on medium containing kanamycin, and then the recombinant clonies were screened using colony-PCR. In adition, in this study, the effects of various factors and methods of solid state fermentation and liquid fermentation medium with wheat bran on the renin production by the Rhizomucor miehei were studied. Factors includs the moisture content of the medium, cultivation temperature and metal ions in the three levels, enzyme extract dilution in four levels and duration of cultivation with two levels. The results showed that the coagulation activity of the Rhizomucor miehei enzymatic extract in the solid state fermentation was higher than that of the and liquid fermentation. The coagulation activity of the enzymatic extract frpm the solid state fermentation with 5% moisture for 10 days at 30 ˚C and 37 ˚C temperatures were significantly higher than those of other treatments. In adition, the enzymatic extract of the solid state fermentation at 42 ˚C for 5 days, has the higher coagulation activity at the 1:50 dilution, as compared with other dilutions. The protease activity of Rhizomucor miehei enzymatic extract was significantly influenced by the metal ions used in the medium. So that, among the liquid media, the highest protease activity was observed in the enzymatic extracts obtained fro the culturers on the medium containing MgCl2 at 37 ˚C for 5 days. The results was also showed that the optimum condition for production of Rhizomucor miehei renin with desiered MC/PA, is the solid state fermentation with 5% moisture at 30 ˚C for 10 days. Keywords: Milk- clouting enzyme, Rrennin, Rhizomucor miehei

Item Type: Thesis (Masters)
Persian Title: جداسازی ژن رنین ازقارچ رایزوموکور میهی (Rhizomucor miehei)
Persian Abstract: در این پژوهش ابتدا توالی رمز کننده (CDS) ژن رنین در قارچ رایزوموکور میهی (Rhizomucor miehei) از پایگاه اطلاعاتی NCBI تهیه شده و بر اساس آن آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ژن رنین طراحی شد. برای سهولت همسانه سازی ژن در وکتور بیانی pET-28a، جایگاه برشی آنزیم¬های BamHI و EcoRI به انتهای 5’ آغازگرها اضافه شد. در مرحله بعد، RNA کل از قارچ رایزوموکور میهی استخراج شده و سپس با استفاده آغازگر Oligo dT و کیت شرکت سیناکلون cDNAسنتز گردید. در نهایت، cDNAرنین با استفاده از PCRبا آغازگرهای اختصاصی رنین و حاوی جایگاه برشی آنزیم¬های BamHI و EcoRI و با استفاده از Max Tag DNA پلیمراز تکثیر گردید. ژن تکثیر شده در وکتور pET-28a تحت کنترل پروموتر و ترمیناتور T7 همسانه شده و به باکتری E. coli سویه¬ی DH5αانتقال داده شد. گزینش کلونی¬های تراریخته از طریق کشت در محیط حاوی کانامایسین و انتخاب کلونی‌های نوترکیب با استفاده از کلونی PCRانجام گرفت. هم¬چنین در این تحقیق تأثیر عوامل مختلف و روش تخمیر حالت جامد و تخمیر حالت مایع با محیط کشت سبوس گندم بر تولید رنین توسط قارچ رایزوموکور میهی مورد بررسی قرار گرفت. عوامل مورد بررسی شامل درصد رطوبت محیط کشت، دمای کشت و یون¬های فلزی در سه سطح، رقت آنزیم در چهار سطح و مدت زمان کشت در دو سطح بود. نتایج به دست آمده از بهینه¬سازی عوامل فوق نشان داد که فعالیت لخته‏کنندگی عصاره آنزیمی قارچ رایزوموکور میهی در محیط کشت جامد بیشتر از محیط مایع است. فعالیت لخته¬کنندگی عصاره آنزیمی به طور معنی‏داری در محیط جامد با رطوبت 5% در مدت زمان 10 روز تخمیر در دماهای˚C 30 و˚C 37 بیشتر‏ از سایر تیمارها بود. علاوه‌ براین، عصاره آنزیمی حاصل از محیط جامد با دمای °C 42 و مدت زمان 5 روز کشت، در رقت آنزیمی 1:50 فعالیت لخته¬کنندگی بیشتری در مقایسه با سایر رقت¬ها داشت. هم¬چنین، فعالیت پروتئازی عصاره آنزیمی قارچ رایزوموکور میهی به طور معنی‏داری تحت تأثیر یون‌های فلزی مورد استفاده در محیط کشت قرار گرفت. به‌طوری‌که، در بین محیط کشت-های مایع مورد استفاده، عصاره آنزیمی حاصل از کشت در محیط کشت مایع حاوی کلرید منیزیم در دمای ˚C 37 و مدت زمان 5 روز پس از کشت بیش‏ترین فعالیت را نشان داد. هم¬چنین نتایج نشان داد که،مناسب¬ترین شرایط برای تولید رنین قارچ رایزوموکور میهی از نظر نسبت MC/PAعبارت است از محیط کشت جامد با 5% رطوبت در مدت زمان 5 روز پس از کشت و دمای ˚C 37 بود. كليدواژه¬ها: آنزیم لخته کننده شیر، رایزوموکور میهی، رنین
Supervisor:
SupervisorE-mail
Zare, NaserUNSPECIFIED
Fathi, BahramUNSPECIFIED
Advisor:
AdvisorE-mail
Asghari Zakaria, RasoolUNSPECIFIED
Subjects: Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Divisions > Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Divisions: Subjects > Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Date Deposited: 14 Oct 2018 15:14
Last Modified: 14 Oct 2018 15:14
URI: http://repository.uma.ac.ir/id/eprint/680

Actions (login required)

View Item View Item