Gene Delivery to tobacco cells using PLA-PEG-PLA polymers

زارع, دکتر ناصر (2017) Gene Delivery to tobacco cells using PLA-PEG-PLA polymers. University of Mohaghegh Ardabili, University of Mohaghegh Ardabili.

[img] Text
Project Report-10.20.pdf

Download (1MB)
Official URL: http://uma.ac.ir/

Abstract

The combination of nanotechnology and biology (nanobiotechnology) and its advances provides an efficient approach for transferring different materials including nucleic acids into the viable cells. In this research, the capability of PEI and PLA-PEG-PLA Nano polymers for gene delivery into the tobacco protoplast and cells were evaluated. Protoplasts were prepared from in vitro grown plants and cell suspension cultures were established from calli derived from leaf explants. The PLA-PEG-PLA/DNA and PLA-PEG-PLA/PEI/DNA nanoparticles were prepared using water-in-oil solvent diffusion technique. For this, the effects of different ultrasound exposure durations on DNA degradation were evaluated and the exposure duration which did not affect integrity of plasmid DNA, was selected. Then, DNA or PEI/DNA complex were mixed with PLA-PEG-PLA copolymers in the presence of surfactants, and were sonicated with an ultrasonic bath. The nanoparticle’s morphology, size and size distribution were analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and dynamic light scattering (DLS). Toxicity of nanoparticle on tobacco cell suspension was assayed by trypan blue staining method. The results of DLS and SEM analyzes indicated that DNA-PLA-PEG-PLA, PEI/DNA and PEI/DNA/PLA-PEG-PLA complexes were individual and spherical with mean particle sizes of 224, 115and 191 nm, respectively. Treatment of the plasmid DNA with ultrasound for more than 40 seconds caused its complete degradation. However, DNA complexed in the DNA/PEI structures was protected from ultrasound degradation. The results of cytotoxic assay indicated that DNA/PEI particles covered by PLA-PEG-PLA copolymer until 1 mg/ml concentration did not show significant toxicity on tobacco cells. Although the deliveriry efficiency of ssDNA-FITC by PEI/ssDNA-FITC into tobacco protoplasts was higher than that of PEI/ssDNA-FITC/PLA-PEG-PLA complex, but with regard to higher toxicity of PEI/DNA for tobacco cells and protoplasts, the PEI/DNA/PLA-PEG-PLA complex will be more efficient for gene delivery and expression in the protoplasts and cells. Transformation of the tobacco cells with PEI/DNA and PEI/DNA/PLA-PEG-PLA complexes containing the gusA gene casset resulted in the production of transformed cells with blue spots in the GUS histochemical staining. These results demonstrated the abilty of PEI nanoparticles covered by PLA-PEG-PLA copolymers for delivery and sustained release of DNA into the tobacco cells.

Item Type: Other
Persian Title: انتقال ژن به سلول¬های گیاه توتون با استفاده از نانوپلیمر PLA-PEG-PLA
Persian Abstract: ترکیب نانوفناوری و زیست¬شناسی (نانوفناوری زیستی) و پیشرفت‌های آن راهکار موثری را برای انتقال مواد مختلف از جمله اسیدهای نوکلئیک به سلول¬های زنده فراهم آورده است. در این تحقیق قابلیت پلیمرهای PEI و PLA-PEG-PLA برای انتقال ژن به پرتوپلاست و همچنین سلول¬های گیاه توتون مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور گیاهچه¬های توتون حاصل از کشت بذور روی محیط MS برای هضم ناقص و کامل دیواره سلولی و همچنین تهیه سوسپانسیون سلولی مورد استفاده قرار گرفتند. نانوذرات PLA-PEG-PLA/DNA و PLA-PEG-PLA/PEI/DNA، مورد استفاده در این تحقیق با استفاده از روش Water-in-oil solvent diffusion technique تولید شدند. بدین منظور ابتدا تاثیر مدت زمان‌های مختلف تیمار امواج فراصوت بر شکست و تخریب DNA مورد بررسی قرار گرفت و مدت زمانی از تیمار اولتراسوند که باعث تخریب DNA نمی‌شود انتخاب گردید. سپس کمپلکس PEI/DNA و DNA، به طور جداگانه و در حضور سورفکتانت و امواج فراصوت با کوپلیمر PLA-PEG-PLA ترکیب شدند. خصوصیات مرفولوژیکی و اندازه نانوذرات حاصل به ترتیب با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و دستگاه DLS مورد بررسی قرار گرفت. سمیت نانوذرات فوق روی سلول‌های سوسپانسیون توتون با استفاده از رنگ¬آمیزی تریپان¬بلو مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آنالیز SEMو DLS نشان داد که کمپلکس‌های DNA/PLA-PEG-PLA، PEI/DNA و PEI/DNA/ PLA-PEG-PLA منفرد و کروی شکل بوده و میانگین اندازه ذرات به ترتیب برابر با 224، 115 و 191 نانومتر بود. تیمار DNA پلاسمیدی با اولتراسوند به مدت 40 ثانیه و بیشتر از آن DNA پلاسمیدی را به طور کامل تخریب کامل نمود، ولی نانوذرات PEI باعث حفظت DNA موجود در ساختار کمپلکس DNA/PEI از تخریب ناشی از اولتراسوند گردید. این امر نشان می‌دهد که می‌توان از تیمار امواج فراصوت برای افزایش کارایی انتقال DNA با استفاده از این نانوذرات استفاده نمود. نتایج حاصل از بررسی سمیت نانوذرات نشان داد پوشش ذرات PEI/DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG-PLA باعث کاهش سمیت نانوذرات PEI گردید به‌طوریکه کمپلکس PEI/DNA/ PLA-PEG-PLA تا غلظت mg/l1 سمیت معنی‌داری برای سلول‌های توتون نشان نداد. اگرچه کارایی انتقال DNA تک‌رشته‌ایی نشاندار شده با FITC به پروتوپلاست توتون با استفاده از کمپلکس PEI/ssDNA-FITC بیشتر از کارایی انتقال آن از طریق کمپلکس PEI/ssDNA-FITC/ PLA-PEG-PLA بوده ولی با توجه سمیت بالاتر کمپلکس PEI/DNA برای پروتوپلاست و سلول‌های توتون در مقایسه با کمپلکس PEI/DNA / PLA-PEG-PLA، استفاده از کمپلکس اخیر برای انتقال و بیان ژن در پروتوپلاست و سلول‌ها از کارآیی بالاتری برخوردار خواهد بود. علاوه‌براین، انتقال DNA پلاسمیدی حاوی ژن gus A با استفاده از کمپلکس‌های PEI/DNA و PEI/DNA/PLA-PEG-PLA نشان داد که این نانوذرات از توانایی انتقال و رهش سالم DNA به سول‌های توتون برخوردار هستد. به طوری‌که در سلول‌های ترانسفورم شده لکه‌های آبی رنگ ناشی از بیان ژن gus A مشاهده گردید.
Subjects: Research Projects
Divisions: Subjects > Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Faculty of Agricultural Sciences & Natural Resources > Department of Agronomy & Plant Breeding
Date Deposited: 30 Jun 2019 06:37
Last Modified: 30 Jun 2019 06:37
URI: http://repository.uma.ac.ir/id/eprint/8324

Actions (login required)

View Item View Item